Aktywność farmaceutyczna i biologiczna olejków eterycznych: Mechanizmy działania i potencjał terapeutyczny

Wprowadzenie i definicje podstawowe

Definicja aktywności farmaceutycznej

Aktywność farmaceutyczna definiuje się jako zdolność substancji do wywoływania specyficznych efektów biologicznych poprzez oddziaływanie z określonymi celami molekularnymi w organizmie żywym. W przypadku olejków eterycznych aktywność farmaceutyczna obejmuje mechanizmy farmakokinetyczne i farmakodynamiczne realizowane na poziomie molekularnym, komórkowym i ustrojowym. Kluczowe znaczenie ma zależność dawka-odpowiedź oraz selektywność oddziaływania z receptorami, enzymami czy innymi białkami docelowymi.

Mechanizmy farmakokinetyczne olejków eterycznych obejmują procesy absorpcji, dystrybucji, metabolizmu oraz eliminacji ich składników aktywnych. Właściwości fizykochemiczne głównych konstytuentów, takich jak lipofilność i niska masa molekularna, determinują ich biodostępność oraz zdolność do przekraczania barier biologicznych, w tym bariery krew-mózg.

Farmakodynamika olejków eterycznych realizowana jest poprzez interakcje z wieloma celami molekularnymi. Mechanizmy obejmują modyfikację aktywności enzymów metabolicznych, interakcje z receptorami błonowymi oraz wpływ na integralność struktur komórkowych. Charakterystyczne jest wielokierunkowe działanie wynikające z kompleksowego składu chemicznego.

Definicja aktywności biologicznej

Aktywność biologiczna odnosi się do zdolności substancji do modulowania procesów życiowych na poziomie komórkowym, tkankowym i ustrojowym poprzez interakcje z różnorodnymi celami biologicznymi. W kontekście olejków eterycznych aktywność biologiczna manifestuje się jako wpływ na funkcje fizjologiczne organizmu, włączając procesy immunologiczne, metaboliczne oraz homeostazy komórkowej.

Aktywność biologiczna charakteryzuje się spektrum oddziaływań obejmujących modulację ekspresji genów, wpływ na szlaki sygnalizacyjne komórek oraz regulację procesów enzymatycznych. Istotnym aspektem jest zdolność do indukowania odpowiedzi adaptacyjnych organizmu oraz modulowania jego reaktywności na czynniki stresowe.

Współczesne badania wykazują, że aktywność biologiczna olejków eterycznych realizowana jest poprzez kompleksowe mechanizmy obejmujące bezpośrednie oddziaływania molekularne oraz pośrednie efekty wynikające z modulacji funkcji komórkowych. Szczególne znaczenie ma zdolność do indukowania zmian w ekspresji genów odpowiedzialnych za odpowiedź przeciwzapalną, antyoksydacyjną oraz immunomodulacyjną.

Charakterystyka olejków eterycznych

Według definicji Międzynarodowej Organizacji Standaryzacji (ISO), olejki eteryczne to produkty pozyskiwane z surowców roślinnych poprzez destylację z parą wodną lub wodą, z skórki owoców cytrusowych metodami mechanicznymi lub przez destylację suchą. Stanowią złożone mieszaniny lotnych związków organicznych charakteryzujących się specyficznymi właściwościami organoleptycznymi oraz szerokim spektrum aktywności biologicznej.

Skład chemiczny olejków eterycznych zdominowany jest przez terpenoidy i związki fenylpropanoidowe, które nadają charakterystyczny aromat oraz determinują właściwości biologiczne. Główne grupy związków obejmują monoterpeny, sesquiterpeny, diterpeny oraz ich pochodne funkcyjne zawierające grupy hydroksylowe, karbonylowe czy estrowe.

Jakość i skład olejków eterycznych podlegają znacznej zmienności w zależności od czynników botanicznych, geograficznych, klimatycznych oraz technologicznych. Standaryzacja wymaga stosowania zaawansowanych metod analitycznych, w tym chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas, pozwalających na precyzyjną identyfikację i kwantyfikację składników aktywnych.

Podstawy chemiczne aktywności biologicznej

Główne grupy związków aktywnych

Aktywność biologiczna olejków eterycznych determinowana jest przez obecność różnorodnych grup związków organicznych o specyficznych właściwościach strukturalnych i funkcjonalnych.

Monoterpeny i sesquiterpeny stanowią dominującą frakcję większości olejków eterycznych. Limonen, główny składnik olejków cytrusowych, wykazuje udokumentowaną aktywność przeciwnowotworową poprzez indukcję enzymów detoksykacyjnych fazy II oraz modulację apoptozy komórek nowotworowych. α-Pinen i β-pinen, obecne w olejkach iglastych, charakteryzują się właściwościami przeciwdrobnoustrojowymi oraz przeciwzapalnymi, realizowanymi poprzez inhibicję produkcji prozapalnych mediatorów.

Sesquiterpeny, takie jak β-kariofilen, wykazują unikalne właściwości farmakologiczne wynikające z selektywnego wiązania z receptorami kannabinoidowymi CB2. Mechanizm ten odpowiada za działanie przeciwzapalne oraz modulację odpowiedzi immunologicznej bez wywoływania efektów psychoaktywnych charakterystycznych dla agonistów receptorów CB1.

Związki fenolowe charakteryzują się szczególnie wysoką aktywnością biologiczną wynikającą z obecności grup hydroksylowych zdolnych do donacji atomów wodoru. Karvakrol i tymol, główne składniki olejków z oregano i tymianku, wykazują silne działanie bakteriobójcze poprzez destabilizację błon komórkowych mikroorganizmów oraz inaktywację kluczowych enzymów metabolicznych.

Eugenol, dominujący składnik olejku goździkowego, charakteryzuje się wielokierunkową aktywnością obejmującą działanie znieczulające miejscowo, przeciwzapalne oraz przeciwdrobnoustrojowe. Mechanizm działania znieczulającego realizowany jest poprzez blokowanie kanałów sodowych w błonach neuronów, podczas gdy aktywność przeciwzapalna wynika z inhibicji cyklooksygenazy i 5-lipooksygenazy.

Aldehydy i ketony aromatyczne wnoszą specyficzne właściwości farmakologiczne do profilu aktywności poszczególnych olejków. Geranial i neral, główne składniki olejku cytrynowego, wykazują działanie przeciwwirusowe poprzez inaktywację białek otoczkowych wirusów oraz interferują z procesami adhezji i penetracji komórek gospodarza.

Kafr, ketonowy składnik olejku rozmarynowego, charakteryzuje się właściwościami neurotropowymi oraz analgetycznymi. Mechanizm działania obejmuje modulację przewodnictwa nerwowego oraz wpływ na uwalnianie neurotransmiterów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Zależności struktura-aktywność

Analiza zależności struktura-aktywność (SAR) olejków eterycznych ujawnia kluczowe elementy strukturalne odpowiedzialne za specificzną aktywność biologiczną. Obecność grup funkcyjnych, takich jak hydroksyl, karbonyl czy podwójne wiązania, determinuje mechanizmy oddziaływania z celami molekularnymi.

Związki fenolowe wykazują najwyższą aktywność przeciwdrobnoustrojową, co koreluje z liczbą i pozycją grup hydroksylowych w pierścieniu benzenowym. Orto-dwufenole charakteryzują się wyższą aktywnością niż ich izomery meta i para, co wynika z możliwości tworzenia wiązań wodorowych wewnątrzcząsteczkowych stabilizujących strukturę.

Stereochemia odgrywa fundamentalną rolę w determinowaniu aktywności biologicznej terpenów. Enantiomery często wykazują różną aktywność wobec tych samych celów biologicznych, co wynika z chiralnoci miejsc wiązania w białkach docelowych. (+)-Limonen wykazuje silniejsze działanie przeciwnowotworowe niż (-)-limonen, podczas gdy R-kariofilen charakteryzuje się wyższym powinowactwem do receptorów kannabinoidowych niż izomer S.

Synergizm składników w naturalnych mieszaninach stanowi kluczowy aspekt aktywności olejków eterycznych. Interakcje synergistyczne mogą prowadzić do wzmocnienia działania, redukcji toksyczności oraz rozszerzenia spektrum aktywności. Mechanizmy synergizmu obejmują modulację farmakokinetyki składników, addytywne oddziaływanie na różne cele molekularne oraz antagonizowanie mechanizmów oporności.

Farmakokinetyka olejków eterycznych

Właściwości farmakokinetyczne olejków eterycznych determinowane są przez charakterystyki fizykochemiczne ich składników, w tym lipofilność, wielkość cząsteczki oraz stabilność metaboliczną.

Absorpcja olejków może następować poprzez różne drogi aplikacji. Absorpcja przez skórę ułatwiona jest przez niską masę molekularną głównych składników oraz ich lipofilny charakter umożliwiający penetrację przez barierę naskórkową. Szybkość penetracji zależy od współczynnika podziału oktanol-woda oraz stężenia aplikowanego olejku.

Absorpcja wziewna poprzez układ oddechowy charakteryzuje się szczególnie szybką kinetyką wynikającą z rozbudowanej powierzchni wymiany gazowej w pęcherzykach płucnych. Związki lotne szybko przedostają się do krążenia systemowego, omijając metabolizm pierwszego przejścia w wątrobie.

Absorpcja doustna podlega znacznym modyfikacjom w przewodzie pokarmowym, gdzie składniki olejków mogą ulegać degradacji w środowisku kwaśnym żołądka oraz intensywnemu metabolizmowi pierwszego przejścia w wątrobie.

Dystrybucja składników olejków charakteryzuje się predylekcją do tkanek o wysokiej zawartości lipidów, w tym tkanki nerwowej, tkanki tłuszczowej oraz błon komórkowych. Związanie z białkami osocza jest stosunkowo niskie dla większości monoterpenów, co ułatwia ich dystrybucję do tkanek docelowych.

Metabolizm olejków eterycznych realizowany jest głównie w wątrobie poprzez enzymy cytochromu P450, szczególnie CYP2B6 i CYP3A4. Główne szlaki metaboliczne obejmują hydroksylację, epoksydację oraz kooniugację z kwasem glukuronowym. Metabolity często zachowują część aktywności biologicznej związku macierzystego lub wykazują odmienne spektrum działania.

Eliminacja następuje głównie poprzez nerki w postaci metabolitów hydrofilnych oraz przez płuca w przypadku niezmiennych składników lotnych. Okres półtrwania większości monoterpenów wynosi od kilku do kilkunastu godzin, co determinuje częstotliwość dawkowania w zastosowaniach terapeutycznych.

Mechanizmy działania przeciwdrobnoustrojowego

Aktywność przeciwbakteryjna

Olejki eteryczne wykazują szerokie spektrum aktywności przeciwbakteryjnej poprzez wielokierunkowe mechanizmy oddziaływania z strukturami komórkowymi patogenów. Główne mechanizmy działania bakteriobójczego obejmują destabilizację błony komórkowej, inaktywację enzymów metabolicznych oraz uszkodzenie materiału genetycznego.

Destabilizacja błony komórkowej stanowi pierwotny mechanizm działania przeciwbakteryjnego większości olejków eterycznych. Lipidowe składniki olejków, szczególnie monoterpeny o charakterze hydrofobowym, integrują się z dwuwarstwą lipidową błony bakteryjnej, powodując zwiększenie jej przepuszczalności. Proces ten prowadzi do niekontrolowanego wypływu jonów potasu, aminokwasów oraz nukleotydów z wnętrza komórki, co skutkuje utratą homeostazy osmotycznej i śmiercią bakterii.

Związki fenolowe, takie jak karvakrol i tymol, wykazują szczególnie wysoką aktywność przeciwko błonom bakteryjnym poprzez solubilizację składników lipidowych oraz denaturację białek błonowych. Mechanizm ten jest szczególnie skuteczny wobec bakterii Gram-dodatnich, których błona cytoplazmatyczna stanowi główną barierę zabezpieczającą.

Inaktywacja enzymów metabolicznych realizowana jest poprzez oddziaływanie składników aktywnych olejków z grupami sulfhydrylowymi kluczowych enzymów bakteryjnych. Szczególnie podatne są enzymy zaangażowane w łańcuch oddechowy oraz biosyntezę ATP. Eugenol i cynamaldehyd wykazują zdolność do nieodwracalnej inaktywacji dehydrogenaz mitochondrialnych, co prowadzi do zaburzeń energetycznych komórki bakteryjnej.

Inhibicja syntezy białek stanowi dodatkowy mechanizm działania przeciwbakteryjnego niektórych składników olejków. Terpen perillaldehyd interferuje z funkcjonowaniem rybosomów bakteryjnych, blokując translację mRNA i prowadząc do zahamowania wzrostu bakterii.

Uszkodzenie materiału genetycznego obejmuje bezpośrednie oddziaływanie z DNA bakteryjnym oraz interferecję z procesami replikacji i transkrypcji. Niektóre składniki olejków, w tym limonene oxide oraz α-terpineol, wykazują zdolność do interkalacji pomiędzy zasady nukleotydowe DNA, co prowadzi do destabilizacji struktury podwójnej helisy oraz błędów w replikacji.

Badania wykazują, że większość olejków eterycznych jest bardziej aktywna przeciwko bakteriom Gram-dodatnim niż Gram-ujemnym. Różnica ta wynika z obecności zewnętrznej błony lipopolisacharydowej u bakterii Gram-ujemnych, która stanowi dodatkową barierę dla składników hydrofobowych olejków.

Spektrum aktywności przeciwbakteryjnej obejmuje patogeny o znaczeniu klinicznym, w tym oporne szczepy. Olejek z oregano wykazuje skuteczność wobec Staphylococcus aureus opornego na metycylinę (MRSA), podczas gdy olejek z drzewa herbacianego jest aktywny przeciwko Pseudomonas aeruginosa oraz Escherichia coli produkującej β-laktamazy o rozszerzonym spektrum (ESBL).

Właściwości przeciwwirusowe

Mechanizmy aktywności przeciwwirusowej olejków eterycznych różnią się w zależności od typu wirusa oraz stadium cyklu infekcyjnego. Główne mechanizmy obejmują bezpośrednią inaktywację cząstek wirusowych, blokowanie adhezji i penetracji komórek gospodarza oraz interferencję z replikacją wirusową.

Inaktywacja wirusów otoczkowych realizowana jest poprzez rozpuszczenie lipidowej otoczki wirusowej przez składniki lipofilne olejków. Mechanizm ten jest szczególnie skuteczny wobec wirusów RNA otoczkowych, takich jak wirus grypy, wirusy herpes oraz koronawirusy. Składniki terpenowe powodują dezintegrację otoczki lipidowej, co uniemożliwia wirusowi adhezję do receptorów komórkowych oraz penetrację błony komórkowej gospodarza.

Eukaliptol i α-terpineol wykazują szczególnie wysoką aktywność wobec wirusów oddechowych poprzez destabilizację białek otoczkowych odpowiedzialnych za fuzję z błoną komórkową. Badania in vitro potwierdzają skuteczność tych związków wobec wirusa grypy A oraz wirusów parainfluenzy.

Blokowanie replikacji wirusowej obejmuje interferencję z kluczowymi enzymami wirusowymi oraz modulację procesów transkrypcji i translacji. Związki fenolowe, szczególnie eugenol oraz izoeugenol, wykazują zdolność do inhibicji polimerazy RNA wirusów, co prowadzi do zahamowania syntezy genomu wirusowego oraz białek strukturalnych.

Monoterpeny, takie jak limonen oraz α-pinen, interferują z procesami posttranslacyjnej modyfikacji białek wirusowych, w tym glikozylacji oraz proteolitycznego cięcia prekursorów białkowych. Mechanizm ten jest szczególnie istotny w przypadku wirusów wymagających specyficznych modyfikacji białek dla zachowania infektuości.

Modulacja odpowiedzi immunologicznej gospodarza stanowi pośredni mechanizm działania przeciwwirusowego olejków eterycznych. Stymulacja produkcji interferonów typu I oraz aktywacja komórek Natural Killer prowadzi do wzmocnienia naturalnej odporności przeciwwirusowej organizmu.

Sesquiterpeny, w tym β-kariofilen oraz humulen, wykazują zdolność do modulacji funkcji komórek dendrytycznych oraz makrofagów, co prowadzi do zwiększonej prezentacji antygenów wirusowych oraz aktywacji odpowiedzi T-komórkowej. Mechanizm ten może wykazywać szczególną wartość w terapii przewlekłych infekcji wirusowych.

Działanie przeciwgrzybicze

Aktywność przeciwgrzybicza olejków eterycznych realizowana jest poprzez specyficzne mechanizmy skierowane przeciwko unikalnym strukturom komórek grzybiczych. Główne cele obejmują ścianę komórkową, błonę cytoplazmatyczną oraz specyficzne szlaki metaboliczne grzybów.

Uszkodzenie ściany komórkowej grzybów następuje poprzez degradację β-glukanów oraz chityny, głównych składników strukturalnych ściany komórkowej. Związki terpenowe, szczególnie terpinen-4-ol oraz γ-terpinen, wykazują zdolność do aktywacji endogennych enzymów litycznych grzybów, co prowadzi do autolizy ściany komórkowej.

Mechanizm ten jest szczególnie skuteczny wobec grzybów dermatofitowych, gdzie destrukcja ściany komórkowej prowadzi do osmotycznej lizy komórek. Olejek z drzewa herbacianego wykazuje udokumentowaną skuteczność kliniczną w leczeniu dermatomykoz stóp oraz paznokci.

Zakłócanie syntezy ergosterolu stanowi kluczowy mechanizm działania przeciwko grzybom patogennym. Ergosterol, główny sterol błonowy grzybów, odgrywa fundamentalną rolę w utrzymaniu integralności oraz funkcjonalności błony cytoplazmatycznej. Związki fenolowe, w tym karvakrol oraz tymol, inaktywują enzymy zaangażowane w biosyntezę ergosterolu, szczególnie 14α-demetylazę oraz reduktazę skwalenu.

Zaburzenia syntezy ergosterolu prowadzą do akumulacji prekursorów sterolowych o właściwościach toksycznych dla komórki grzybiczej oraz zwiększonej przepuszczalności błony cytoplazmatycznej. Mechanizm ten wykazuje synergizm z konwencjonalnymi lekami przeciwgrzybiczymi z grupy azoli.

Indukcja stresu oksydacyjnego w komórkach grzybiczych realizowana jest poprzez zwiększoną produkcję reaktywnych form tlenu oraz wyczerpanie endogennych systemów antyoksydacyjnych. Aldehydy terpenowe, takie jak citral oraz cynamaldehyd, aktywują enzymy produkujące nadtlenek wodoru oraz anion ponadtlenkowy, przekraczając możliwości obronne grzybów.

Stres oksydacyjny prowadzi do peroksydacji lipidów błonowych, oksydacji grup sulfhydrylowych białek enzymatycznych oraz uszkodzeń DNA mitochondrialnego. Mechanizm ten wykazuje szczególną skuteczność wobec grzybów z rodzaju Candida oraz Aspergillus.

Mechanizmy oporności i strategie przezwyciężania oporności

Mechanizmy oporności mikroorganizmów na olejki eteryczne są zwykle związane ze zmianami strukturalnymi błon komórkowych, zwiększoną ekspresją pomp efflux oraz modyfikacją celów molekularnych. Adaptacje te mogą prowadzić do zmniejszenia przenikania składników aktywnych, ich szybszego usuwania z komórki lub obniżenia powinowactwa do celów molekularnych.

Strategie przezwyciężania tych mechanizmów obejmują zastosowanie kombinacji różnych olejków eterycznych oraz łączenie ich ze standardowymi antybiotykami. Synergistyczne działanie mieszanin olejków może obniżać skuteczną dawkę terapeutyczną, ograniczać toksyczność oraz redukować możliwość rozwoju oporności.

Potencjał terapeutyczny olejków eterycznych

Terapie przeciwzapalne i immunomodulacyjne

Olejki eteryczne wykazują silny potencjał przeciwzapalny poprzez hamowanie enzymów takich jak cyklooksygenaza (COX) oraz lipooksygenaza (LOX), ograniczając produkcję mediatorów prozapalnych (prostaglandyn, leukotrienów, cytokin). Szczególnie skuteczne są olejki z rumianku, lawendy oraz kadzidłowca, których składniki aktywne (α-bisabolol, linalol, boswellic acid) modulują odpowiedź immunologiczną i zmniejszają stan zapalny w chorobach przewlekłych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów czy astma oskrzelowa.

Potencjał przeciwnowotworowy

Badania wykazały, że niektóre składniki olejków eterycznych, takie jak limonen, α-pinen, β-kariofilen oraz geraniol, posiadają obiecujące właściwości przeciwnowotworowe. Mechanizmy ich działania obejmują indukcję apoptozy komórek nowotworowych, hamowanie angiogenezy oraz modulację szlaków sygnałowych związanych z proliferacją komórek. Obiecujące wyniki uzyskano w badaniach in vitro oraz in vivo dla nowotworów piersi, prostaty, skóry oraz jelita grubego.

Właściwości neuroprotekcyjne

Składniki olejków eterycznych, takie jak linalol (lawenda), borneol (rozmaryn) i α-pinen (igły sosnowe), wykazują działanie neuroprotekcyjne poprzez ograniczenie stresu oksydacyjnego, redukcję neurozapalnych procesów oraz modulację neurotransmisji. Olejki te są badane pod kątem potencjału w terapii chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera, Parkinsona oraz neuropatii obwodowych.

Potencjał w leczeniu chorób skóry

W dermatologii olejki eteryczne są wykorzystywane zarówno ze względu na swoje działanie przeciwdrobnoustrojowe, jak i przeciwzapalne oraz regeneracyjne. Olejek z drzewa herbacianego, lawendowy czy rozmarynowy znajdują zastosowanie w leczeniu trądziku, łuszczycy oraz atopowego zapalenia skóry. Ich efektywność jest potwierdzona licznymi badaniami klinicznymi, które wskazują na poprawę stanu skóry oraz ograniczenie objawów chorobowych.

Aromaterapia kliniczna

Aromaterapia wykorzystuje inhalacje oraz aplikacje miejscowe olejków eterycznych do modulowania fizjologicznych i psychologicznych funkcji organizmu. Efektywność terapeutyczna aromaterapii została potwierdzona w redukcji stresu, lęku, bezsenności oraz w terapii bólu przewlekłego. Olejek lawendowy, bergamotowy oraz melisowy są szczególnie cenione za swoje działanie relaksujące i przeciwlękowe.

Bezpieczeństwo stosowania i potencjalne działania niepożądane

Chociaż olejki eteryczne są substancjami pochodzenia naturalnego, ich stosowanie wymaga ostrożności ze względu na potencjalne działania drażniące, alergizujące oraz toksyczne przy nieodpowiednim dawkowaniu. Istotne jest przestrzeganie zasad stosowania, unikanie wysokich stężeń i stosowanie odpowiednich rozcieńczeń w nośnikach takich jak oleje roślinne.

Szczególną uwagę należy zwrócić na olejki zawierające związki fenolowe (np. tymol, karwakrol), które mogą powodować podrażnienia skóry oraz błon śluzowych. U osób wrażliwych oraz dzieci zaleca się stosowanie bardziej delikatnych olejków, np. rumiankowego lub lawendowego.

Podsumowanie

Aktywność farmaceutyczna i biologiczna olejków eterycznych wynika z ich złożonego składu chemicznego i wielokierunkowych mechanizmów działania. Badania naukowe potwierdzają ich potencjał w terapii infekcji, chorób zapalnych, nowotworowych oraz neurodegeneracyjnych. Kluczowe pozostają dalsze badania kliniczne oraz rozwój metod standaryzacji składów, co pozwoli na pełne wykorzystanie ich potencjału terapeutycznego w praktyce medycznej i aromaterapii.

Bibliografia

1. Bakkali, F., Averbeck, S., Averbeck, D., & Idaomar, M. (2008). Biological effects of essential oils – A review. Food and Chemical Toxicology, 46(2), 446-475.
2. Edris, A. E. (2007). Pharmaceutical and therapeutic potentials of essential oils and their individual volatile constituents: a review. Phytotherapy Research, 21(4), 308-323.
3. Hammer, K. A., Carson, C. F., & Riley, T. V. (1999). Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts. Journal of Applied Microbiology, 86(6), 985-990.
4. Miguel, M. G. (2010). Antioxidant and anti-inflammatory activities of essential oils: a short review. Molecules, 15(12), 9252-9287.
5. Silva, G. L., Luft, C., Lunardelli, A., Amaral, R. H., Melo, D. A., Donadio, M. V. F., … & de Oliveira, J. R. (2015). Antioxidant, analgesic and anti-inflammatory effects of lavender essential oil. Anais da Academia Brasileira de Ciências, 87(2), 1397-1408.